Large preparaton of plasmid DNA
97.5.12
1. 一晩培養した 440 ml LB を遠心管に移し、7000 rpm, 10 min, 4｡C で集菌。
2. 残った上清はペーパータオルでふき取る。冷 buffer A 20 ml をディスポピペットで加え、
ペレットをピペッティングにより懸濁、室温で 7.5 min 静置。
3. 0.2 M NaOH, 1 % SDS 40 ml を加え、静かに混合、氷温で 7.5 min 静置。
（10M NaOH 0.8 ml + 10% SDS 4 ml + dH2O 35.2 ml ）
4. 冷 buffer B 30 ml を加え、静かに混合、氷温で静置。5 min 間隔で状態を確認しながら、
静かに容器を回す。液層が清澄となったら、次に進む。（ 7.5 〜 必要に応じ 30 min ）
5. 7000 rpm, 20 min, 4 ｡C。
6. 乾熱滅菌したメスシリンダーに、上清を滅菌ガーゼで濾過する。これをオートクレ
ーブした遠心管に移し、2 倍量の95 % EtOH を加え、室温で5 min 静置。
7. 7000 rpm, 20 min, 4 ｡C。
8. 沈殿を 70 % EtOH で洗浄し、減圧乾燥。
[9] このステップより［
14］まではサンプルにより行う。15 ml TE に溶解し、50 ml コーニングチューブ（オレンジキャップ）に移す。
[10] RNase A を 20 _l (10 mg/ml) を加え、37 ｡C, 30 min 反応させる。
[11] Phenol / CHCl3 15 ml を加え、vortex, 1 min 。
[12] 水層を別のチューブに移し、CHCl3 15 ml を加え、vortex, 20 sec 。
[13] 水層を別のチューブに移し、3M NaOAc 1.5 ml, 95 % EtOH 30 ml を加え、
-20 ｡C, 10 分静置。
[14] 3000 rpm、15 分遠心し、70 % EtOH でペレットをリンス、減圧乾燥する。
15.
全量で 950 _l となるよう（ペレットの乾燥状態により、500 - 800 _l ） TE を添加。16. 1.15 g CsCl と 100
_l EtBr（10 g/l）、13 _l 1%Triton 水溶液を加え、混合。15000 rpm、5 分遠心、上清を超遠心用チューブにシリンジで移す。（注射針（#18））
17. 950
_l TE と 1.15 g CsCl と 100 _l EtBr（10 g/l）、13 _l 1%Triton 水溶液を混合し、これを超遠心用チューブの肩口まで加える。（バランス用）
18. 120,000 rpm、20 ｡C、16 時間遠心。
19. 遠心を止めたら、その場でサンプルのバンドをシリンジで吸引（注射針（#23））、
15 ml チューブに入れる。
20. ２倍量の n-BuOH を加え、激しく撹拌して、遠心分離。
ブタノール層を廃棄。
新たに２倍量の n-BuOH を加え、激しく撹拌して、遠心分離。
水層が透明になるまで、EtBr
をブタノールで抽出する．21. 水層（下層）をパスツールピペットで取り、別のチューブに移す。
22. 全量が 2-4 ml となるように TE を加え、２倍量の 95 % EtOH を添加し、15 分氷冷。
23. 3000 rpm, 15
分遠心。24. 70 % EtOH
でペレットをリンス、減圧乾燥。25.
適当量（ 1 ml ）前後の TE にサンプルを溶解し、紫外部の吸光度より
DNA 濃度を算出。